動物神經(jīng)行為實驗方法

一、Morris水迷宮系統(tǒng)的組成

Morris實驗系統(tǒng)由水迷宮裝置、水迷宮圖像自動采集和SuperMaze軟件/VisuTrack分析系統(tǒng)組成。

1、Morris水迷宮裝置:主要由裝水的水池和一個可調節(jié)高度和可移動位置的站臺所組成。

2、水迷宮圖像自動采集和軟件分析系統(tǒng):該系統(tǒng)的主要部件為攝像機、計算機和圖像采集卡等。這種系統(tǒng)有多種型號,但工作原理和流程大致相似:攝像頭采集大鼠游泳圖像(模擬信號)輸入到計算機中的圖像采集卡進行模/數(shù)轉換,大鼠游泳的模擬圖像轉化為數(shù)字圖像儲存于硬盤中,將數(shù)字圖像進行圖像分析得到有關的測試參數(shù)。軟件分析系統(tǒng)能自動地采集動物的入水位置、游泳的速度、搜索目標等所需時間、運行軌跡和搜索策略等參數(shù),并可將所采集的各種資料進行統(tǒng)計和分析。

二、硬件選擇的注意事項

1、水池和站臺

對于水池的大小，存在一個人為選擇的問題，看起來應該統(tǒng)一標準，其實并不容易。但是有個原則就是水池不能太小，站臺也不能太大。Morris初（1981年）用于大鼠的水池是直徑1.32米、高為0.6米，水池的水深為0.40米;但后來（1984年）改為直徑2.14米、高0.4米，水池的水深為0.25米。對于小鼠的實驗水池，文獻中介紹的迷宮直徑差異巨大，小到0.6米, 大到2.0米。一般而言，過小的水池使小鼠爬上平臺的偶然性增加，任務難度減小。過大的水池會使小鼠游泳路徑延長，體力消耗過大，爬上站臺的機率減少。

現(xiàn)在國內文獻中所用水迷宮水池大多數(shù)為大鼠1.6m或1.8m居多，而小鼠一般為1m或1.2m，高0.5m。站臺一般為圓形，直徑可分為大鼠12cm,小鼠6cm,表面粗糙，高度一般為30cm。國外文獻中所用水迷宮水池大多數(shù)為大鼠1.8m或2.0m居多，高0.6m,站臺直徑10cm；而小鼠一般為1m到1.5m，高0.3m站臺直徑5cm。

型號：XR-XM101

2、 水溫

水的溫度要求實驗過程中恒溫。大鼠溫度范圍一般為25± 1℃，小鼠可能低一些，在18~22℃左右。有文獻報道，對小鼠進行了水溫對迷宮成績影響的觀察，結果發(fā)現(xiàn)27~28℃組的小鼠成績差，而17~18℃組和21~22℃組小鼠的學習成績沒有區(qū)別，所以，我們推薦小鼠水迷宮的實驗用21~22℃水。水溫對潛伏期影響很大，特別是大鼠，如果溫度過高，大鼠在游幾次后漸漸適應了迷宮環(huán)境，它就會把迷宮當“浴盆”了，放進去以后，就漂浮不動；如果水溫過低，大鼠體溫下降很快，體力也會耗散太多，大鼠游泳能力不能堅持很久，就會出現(xiàn)有幾次潛伏期突然增大的現(xiàn)象。甚至有些老鼠會出現(xiàn)較明顯的應激反應，比如說會出現(xiàn)抽筋，腹瀉現(xiàn)象。水溫一般保持25度左右，另外氣溫也會導致水溫偏差過大，應人為的調節(jié)水溫。所以就要求在水池的底部裝有可以恒定保持水溫的加熱棒或者其他加熱裝置了。

3、 光源

要保證水池水面上沒有光影，主要是要避免光線在水面的反射問題，以免留在水面的光照影子被軟件的采集系統(tǒng)將光影和鼠的影子混淆；如果是白色的水池背景，就可以在水池上方用兩根條形的發(fā)散日光燈，這樣可以減少反射光在水面的背影；如果是黑色的水池背景，就在水池四個象限的上方放置4個60瓦的燈泡或25瓦的管燈，不用功率特別大的燈。燈泡的高度應該足夠高，不能被攝像頭捕獲到。另外還可以在水池四周裝一圈簾子（顏色一般是黑色、淺藍色或者白色），這樣可以將光的影子擋住，又保持一定的透光度。同時也可以減少外界的人站在水池旁邊某個地方或走來走去，對大鼠形成一個不定的空間參照物。

4、 空間線索（參照物）

水池應該置于一個較大的房間內，池壁上懸掛兩個以上物體作為近距離視覺參照物，并在水池外房間內有多種遠距離視覺參照物。比如幾何圖形（正方形、三角形、圓形等）懸掛于水池以外的墻上，高度是必須讓大小鼠在游泳的時候看的見的范圍，所以應該在其視平線以上，這些幾何圖形可以是寬5cm至15cm塑料板制成，高度是必須高過站臺,可以用1m的線掛在水池周圍；這些幾何圖形一般涂成黑色，因為嚙齒類動物對黑色比較敏感；這些幾何圖形一般不少于3個。另外實驗室環(huán)境是一個十分重要的因素,實驗室的設備、儀器、工作臺、椅子、門窗和燈具等陳設的位置和實驗人員進行實驗操作時所站立的位置都可能被大小鼠看見，如果移動會影響實驗結果。因為動物有時會常常利用實驗室內固有的環(huán)境作為它搜索目標時的參照物。

三、實驗流程準則

Morris水迷宮實驗主要測定空間學習記憶能力，主要的實驗內容有隱蔽站臺試驗、空間探索試驗、反向試驗和可視站臺試驗等。在這里主要介紹下文獻里面主要做的隱蔽站臺試驗和空間探索試驗的流程準則。

1、隱蔽站臺試驗

嚙齒類動物第yi次游泳時,一般不會找到藏于水面下的不可見的站臺。若動物在入水游泳60～90s以內仍未能找到水池中的站臺或未能爬上站臺時,實驗人員可將動物引導置于站臺上站立10～30s,使動物體會站在站臺上的感覺,這樣從第二次開始,學習成績就能迅速提高。動物爬上站臺后,讓動物在站臺上站立5～10s。將大鼠從站臺上拿下來,休息30～60s以后再進行下一次訓練。在一般情況下,正常大鼠在經(jīng)過4～6個實驗日訓練后,很快就學會以z快z佳的軌跡搜索到站臺的確切位置。

每天開始時，將鼠任意從四個象限（東北、西北、東南、西南）之一面向池壁放入水中，站臺放置于東南象限， 每次實驗鼠共游泳60～90s來尋找隱藏的站臺。如果成功地找到站臺，鼠可以得到在站臺上的10～30s休息時間；如果60～90s內未能成功的找到站臺，就由實驗人員將鼠人工置于站臺上，且同樣給予10～30s的休息時間。有時鼠可能會在10～30s間隔時間到達之前從站臺上掉下或跳入水中繼續(xù)游泳。一旦這種情況發(fā)生，則將鼠重新放回站臺，并重新計時，使時間間隔到達（10～30s）。這樣可以確保每只鼠在每次實驗后有相等的時間來觀察和獲取空間信息。

2、空間探索試驗                      

隱蔽站臺試驗結束24h后，撤除站臺。然后任選一相同入水點將鼠放入水中，記錄鼠在60s或120s內的游泳路徑，記錄鼠在原站臺象限的停留時間和穿越原站臺次數(shù)，觀察受試鼠的空間定位能力，及在空間探索過程中的變化規(guī)律。在電腦屏幕上用圓形環(huán)標記出站臺原所在位置，這樣可以記錄穿越原站臺所在位置的次數(shù)。

實驗流程準則：

2.1、實驗時間

隱蔽站臺試驗一般設計天數(shù)為4天或者6天，如果是年老體弱鼠可以將天數(shù)設計為4天。訓練時間一般為60s或90s,也有用120s的，不過現(xiàn)在一般都改用60s了，有人做過實驗，大鼠在60～120s之間能夠找到隱藏站臺的次數(shù)差異大約只占其找到平臺總次數(shù)的5%, 這在統(tǒng)計學上是“小概率事件”。也就是說, 大鼠在60s內找不到隱藏站臺的話, 再延長到120s也很難找到。而且60s還可以減小各組的標準差, 可以節(jié)約實驗時間。但問題并非如此簡單，隱蔽站臺試驗潛伏期應采用重復測量, 由于在統(tǒng)計時, 很多研究將大潛伏期直接納入統(tǒng)計, 顯然, 大潛伏期的不同將不可避免地影響統(tǒng)計結果。所以從統(tǒng)計學上了解不同的大潛伏期到底對Morris 水迷宮實驗結果有多大的影響, 如何避免因此帶來的系統(tǒng)誤差等問題尚有待進一步研究。國外文獻報道，如果水池的直徑在2m，可以設置單次訓練時間為120s,直徑在1m至1.5m,選擇訓練時間為60s, 鑒于此，我們認為訓練時間60s較為合適。時間過長，對鼠體力消耗也會過大。

2.2、 實驗次數(shù)

在隱藏站臺試驗中，每天訓練4次，每個象限每天只被使用一次，一定不要將.大鼠連續(xù)地放入同一個象限，因為大鼠可能會憑借位置或其他非記憶信息（如向右轉彎）來定位站臺。而且，接下來每天的象限順序應當改變。在空間探索試驗中，將大鼠置于水池中追蹤120s，這個過程需要重復一次，因為在有些情況下，*實驗會觀察到一些非正常變量，可能一些老鼠在改變了實驗條件后迷失了方向。連續(xù)進行的兩次實驗計算平均值可以減少偏差，可以提供一個較高的精度和對先前學習記憶的較好控制。但是如果實驗次數(shù)多于兩次，將會導致在目的象限活動時間減少，得到不準確的空間探索結果。

2.3、實驗動物

并非所有鼠株都適合于Morris迷宮測試，如近交系BALB/c小鼠不能學會該任務（成績并不隨天數(shù)的增加而進步），129/SvJ小鼠的學習成績也偏差；比如129/SvJ株的小鼠由于有年齡相關性視覺病變，在衰老時完成以視覺為基礎的學習記憶任務時就會出現(xiàn)困難。在C57BL/6鼠，由于嚴重的禿頭癥存在，可能使某些小鼠產(chǎn)生抑郁，加上潰瘍性皮炎，終可能影響小鼠的游泳能力而影響實驗成績；將動物浸入水中可能引起內分泌或其它應激效應，后者與腦損害或藥理學操作間的相互作用具有不確定性；由于體力消耗太大，體溫也喪失過多，一些年老體弱鼠完成任務較困難，甚至會發(fā)生溺水死亡的情況；另外，個體間的成績差異也巨大，比如說，有些正常大鼠放入水中后左右觀望打圈確定方向后直接游到臺上，說明他記憶力比較好，這個現(xiàn)象是很重要的，有的大鼠游泳速度慢些，所以潛伏期時間比癡呆組還大。所以可以先用別的方法把大鼠初篩一下，然后再來做水迷宮實驗。

2.4、實驗人員

實驗者應與受試動物建立良好的感情,讓動物熟悉實驗者的身體信息,如氣味、相貌等。捕捉動物的動作要溫柔,不要刺激動物。忌諱用手抓鼠的尾巴,因為這樣會極大的刺激動物。有人建議在實驗開始的兩三天之前,與鼠親密接觸。實際上鼠的嗅覺很敏感，如實驗人員為女性的話，其身上的香水味不同，都會使鼠的情緒發(fā)生變化的。

下一篇文章會繼續(xù)講解Morris水迷宮實驗的統(tǒng)計方法準則、行為學評價指標介紹、實驗適用范圍以及實驗注意事項。如果您也喜歡這些文章，歡迎您邀請您的朋友關注我們，并將文章轉發(fā)給需要的老師和同學，感謝！