摘要

新物體識別測試(ORT)是一種常用的行為分析方法，也稱作新物體識別測試，用于研究小鼠學(xué)習(xí)和記憶的各個方面。ORT比較簡單，可以在3天內(nèi)完成:習(xí)慣期、訓(xùn)練期和測試期。在訓(xùn)練期間，小鼠可以探索兩個相同的物體。在測試期，將一個訓(xùn)練期的物體替換為一個新物體。因?yàn)樾∈笥幸环N天生的對新奇事物的偏好，如果小鼠識別了熟悉的物體，它就會把大部分時間花在新物體上。由于這種天生的偏好，不需要積極或者消極地強(qiáng)化訓(xùn)練或長時間培訓(xùn)。此外，ORT還可以被許多應(yīng)用領(lǐng)域應(yīng)用改良。比如記憶間隔可以縮短，用來檢查短期記憶，也可以延長，用來檢查長期記憶。藥理學(xué)干預(yù)可用在訓(xùn)練前、訓(xùn)練后或回憶前的不同時間段內(nèi)，用來調(diào)查學(xué)習(xí)的不同階段(即習(xí)得、早期或晚期鞏固或回憶)?？偟膩碚f，ORT是一種相對壓力低且有效的小鼠記憶測試，適用于檢測藥理學(xué)、生物學(xué)或遺傳操作后的神經(jīng)心理變化。

介紹

物體識別測試(ORT)，，是一種快速有效的測試小鼠不同階段學(xué)習(xí)和記憶的方法。它最初是在1988年由Ennaceur和Delacour提出的，主要用于大鼠; 然而當(dāng)時它也被成功地用于小鼠測試。這個測試只需要三個階段：習(xí)慣期、訓(xùn)練期和測試期。訓(xùn)練期只是對兩個相同物體的視覺探索，而測試期會用一個新物體替換之前已探索的物體之一。因?yàn)閲X動物對新奇事物有天生的偏好，嚙齒動物記住熟悉物體的情況下，會花更多的時間探索新物體。

ORT相對于其他嚙齒類動物記憶測試的主要優(yōu)勢：它依賴于嚙齒類動物探索新奇事物的自然傾向。因此，不需要大量的培訓(xùn)課程或任何積極或消極的強(qiáng)化來激勵促進(jìn)。與其他測試相比，ORT的壓力要小得多，而且比Morris水迷宮或Barnes迷宮等常用的記憶測試所需時間要少， 這兩種測試都需要一周甚至更長時間。因此，ORT與許多其他嚙齒類動物記憶測試相比，ORT測試條件更接近于目前研究已認(rèn)知的條件，增加了該測試的生態(tài)學(xué)正確性。類似地，由于ORT是一種簡單的視覺回憶任務(wù)，它已被成功地用于許多物種，包括人類和非人類靈長類動物，用來評估不同物種間的陳述性記憶不同面。最后，ORT可以很容易地進(jìn)行修改，應(yīng)用在檢查學(xué)習(xí)和記憶的不同階段(如獲取、鞏固或回憶)，評估不同類型的記憶(如空間記憶)，或評估不同的保持間隔(如短期記憶vs長期記憶)。

ORT的通用性為無數(shù)的研究應(yīng)用提供了一個平臺。研究可以利用藥物來干擾或增強(qiáng)記憶。在訓(xùn)練前、訓(xùn)練后或測試前改變給藥時間，可以暗示導(dǎo)致記憶中斷或增強(qiáng)的潛在神經(jīng)機(jī)制。類似地，光遺傳技術(shù)可以在這些相同的或不同的時間點(diǎn)上進(jìn)行觀察神經(jīng)激活/抑制，這樣助于學(xué)習(xí)和記憶的不同階段。ORT也適用于評估轉(zhuǎn)基因動物、損傷研究、神經(jīng)退行性模型或衰老研究中的差異。訓(xùn)練和測試之間的時間被稱為記憶保持間隔，可以通過記憶保持間隔的變化來評估短期和長期記憶的變化。最后，ORT可以作為研究學(xué)習(xí)和記憶的藥理學(xué)、遺傳學(xué)和神經(jīng)學(xué)變化的工具，或者這些工具用作研究ORT學(xué)習(xí)和記憶的基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)操作

一. 物體選擇和實(shí)驗(yàn)設(shè)置

1. 選擇不同的物體(需要很容易被小鼠識別)，但也要有相似的復(fù)雜性(紋理，形狀，顏色圖案和正確性等)，最小化任何潛在的可能因素，否則導(dǎo)致結(jié)果偏差。

1.1 測試天生偏好和辨別能力(見步驟2和3)。

1.2 使用和小鼠差不多大的物體或略大的物體，減少誘導(dǎo)偏好，促進(jìn)探索(圖1)， 確保小鼠能夠爬上兩個物體或兩個都爬不上(只能爬上一個物體可能會增加探索的興趣，且爬在一個物體的時間不計入探索時間)。

1.3 每個物體至少有兩個備品。為了盡量減少測試過程中潛在的氣味線索，每個物體至少有3個備品，一個用于訓(xùn)練，一個用于測試。

1.4 使用不易碎材料制成的物品，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)過程中物體損壞而丟失的物品可能會干擾試驗(yàn)的連續(xù)性，并可能對動物造成傷害。

1.5 在使用前和使用時*清潔物品(以70%的乙醇為宜)

2. 為了減少明亮照明的影響，使用擴(kuò)散的低照明設(shè)備，迷宮的中心照明約20lux。使用溫度和濕度相同的房間條件，如果小鼠被從一個房間轉(zhuǎn)移到另一個房間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每天使用前至少要讓小鼠適應(yīng)新房間1小時。

3. 在訓(xùn)練前做好對小鼠的撫摸。因?yàn)檫@個測試依賴于嚙齒類動物探索新奇事物的自然傾向，所以要減少任何壓力或焦慮，否則這些壓力或焦慮可能會干擾它們的探索，以及隨后探索物體的yu望。理想情況下，在試驗(yàn)前1~2周，每天撫摸小鼠1~2次，每次至少1分鐘。

4. 測試箱使用一個正方形的箱體(約40厘米× 40厘米× 40厘米，也可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)修改)，由白色或黑色的無孔塑料制成，與小鼠的顏色形成對比?；蚴褂靡粋€圓形的測試箱，因?yàn)橄噍^于方形測試箱，圓形測試箱可能更適合促進(jìn)探索行為——焦慮的小鼠可能會趴在一個方形測試箱的角落里，圓形測試箱可能更適合促進(jìn)探索行為.

4.1 在訓(xùn)練期時，將兩個相同的物體放在對角線上(即一個在西北角，一個在東南角)。如果物體太輕，小鼠能夠移動物體，可以把物體固定在底板上，可拆卸安裝的膠體將之粘貼在底座上的效果就很好。

4.2 在測試期時，使用每個物體的第三個備品，將一個熟悉的物體和一個新物體放在與訓(xùn)練時相同的對角線上(圖2)。

4.3 平衡每組物體的分配使用，熟悉物體和新物體同時換組使用。在物體在測試箱的四個角落的位置要相同，并且一定要注意哪條對角線用于哪只動物，以便每只小鼠在訓(xùn)練時使用的對角線與在測試時使用的對角線相同。

4.4 在使用前和使用時*清潔設(shè)備和物體以去除氣味(以70%的乙醇為宜)

5. 將相機(jī)安裝在測試箱上方，以獲得最佳的探索視角。為了準(zhǔn)確分析，只使用帶有鼻尖檢測的軟件。使用軟件在開始拍攝前，先拍攝背景圖像，并將物體放置到位。在軟件中，將探測區(qū)域設(shè)置為物體周圍約2~3厘米。

6. 實(shí)驗(yàn)需要記錄下這個試驗(yàn)，然后給它打分。為了減少實(shí)驗(yàn)者的干擾，要讓實(shí)驗(yàn)者在小鼠看不見的地方。如果在實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)行手動評分，請確保實(shí)驗(yàn)者距離測試箱1米以上，并且小鼠無法看到實(shí)驗(yàn)員。

注意:任何時候小鼠停留在物體上而不主動進(jìn)行觸須掃瞄或嗅探都不能算作探索時間。

7. 將探索定義為當(dāng)小鼠的鼻尖指向目標(biāo)物體，并且在距離目標(biāo)2~3厘米的范圍內(nèi)，用主動的觸須掃瞄或嗅探。不計算任何沒有積極探索性質(zhì)的爬在物體上的時間。

二. 必要的試點(diǎn)實(shí)驗(yàn)

1.1 為了小鼠能夠適應(yīng)，把小鼠從籠子里拿出來，并把它放在曠場(測試箱)的中間。允許小鼠自由探索5分鐘。

1.2 在訓(xùn)練期內(nèi)，在測試箱的對角線放置2個不同的物體(即西北和東南角)。把小鼠從它的籠子里拿出來，放在曠場(測試箱)的中央。允許自由探索10分鐘。

1.3 計算識別指數(shù)。如果沒有誘導(dǎo)偏好，則識別指數(shù)應(yīng)在零或接近零。任何顯示優(yōu)先級的物體都不要應(yīng)用于ORT。

2. 識別能力測驗(yàn)

2.1. 為了小鼠能夠適應(yīng)，把小鼠從籠子里拿出來，并把它放在曠場(測試箱)的中間。允許小鼠自由探索5分鐘。

2.2 在訓(xùn)練階段(T1)中，將2個相同的物體放在對角線位置。將小鼠放在測試箱中心，允許小鼠探索10分鐘。

2.3 在測試階段(T2)，將T1期間熟悉的物體備品和一個新物體放在對角線位置(即西北角和東南角)。

T1后60分鐘，將小鼠放在測試箱中心，允許自由探索10分鐘。

2.4 計算識別指數(shù)， 在保持間隔60分鐘時，鑒別指數(shù)應(yīng)高于0.25。

三. 實(shí)驗(yàn)的程序

1.1 把小鼠從它的籠子里拿出來，放在曠場(測試箱)的中間。允許小鼠自由探索5分鐘?；\子如果使用過一遍，就把它留作第二天用的籠子。

1.2 5分鐘后，取出小鼠并放入籠中。不要將小鼠放回原來的籠子，否則可能影響其余待測試小鼠的行為。

1.3用70%的乙醇*清潔小鼠的設(shè)備。

注意:在習(xí)慣化期間，可以通過計算小鼠在曠場中心花費(fèi)的時間來評估類似焦慮的行為

T1的時間長度時是一個有用的度量，高焦慮的小鼠可能需要10分鐘的時間來達(dá)到最di勘探準(zhǔn)則。

2. 訓(xùn)練期(T1)

2.1 將兩個相同的物體放置在測試箱對角線的位置(即東北角和西南角)。

2.2 習(xí)慣化24小時后，將小鼠從鼠籠中取出，置于測試箱中心，與兩個相同的物體保持等距離。

2.3 允許自由探索至少5分鐘。如果使用一只低活動量或探索量的小鼠(如大多數(shù)小鼠沒有在5分鐘內(nèi)探索兩個物體各20s， 同樣適用于試點(diǎn)實(shí)驗(yàn))， 那么就擴(kuò)展隊列中所有小鼠的試驗(yàn)到10分鐘。

2.4 試驗(yàn)結(jié)束時，將小鼠移出并放入籠中?；\子如果使用過一遍，就把它留作測試時的籠舍。

2.5 用70%乙醇*清潔小鼠的設(shè)備和物體。

3.測試期(T2)

3.1 將T1期間使用的一個物體(熟悉的物體)和一個新物體放在測試箱對角線的位置。對每個小鼠都使用它們在T1期間相同的物體位置。

3.2 在T1到T2的選擇間隔時間內(nèi)，將小鼠從籠子中取出，并將它放在測試箱中心，保持和兩個物體的距離等距。

注:在24小時的保留間隔中，大多數(shù)小鼠將無法區(qū)分熟悉的和新的物體(通常-0.2 < d2 < 0作為可信的控制度)，如果測試益智作用，使用這個時間點(diǎn)來探測記憶增強(qiáng)。為了檢測記憶缺陷，根據(jù)小鼠的不同，使用20分鐘到4小時的較短的記憶間隔。

3.3 允許自由探索10分鐘。試驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠移出并放入籠中。

3.4 T1和T2都在前面5分鐘評分。如果小鼠沒有達(dá)到對兩個物體的最小20秒的探索時間，超過5分鐘繼續(xù)評分，直到總探索時間超過20秒。

四. 數(shù)據(jù)分析

1. 排除標(biāo)準(zhǔn)

1.1 在訓(xùn)練(T1)和測試(T2)期間，計算每個期間(e1和e2)中兩個的物體總探索時間。大多數(shù)小鼠兩個目標(biāo)的最小探索時間應(yīng)該是在5分鐘內(nèi)達(dá)到20秒

1.2 對于探索程度低且不滿足最di標(biāo)準(zhǔn)的品系，將T1和T2時間延長至10 min，可以在試點(diǎn)測試期間觀察到。

1.3 評分達(dá)到5分鐘或5分鐘以上，直到達(dá)到20秒的最di標(biāo)準(zhǔn)。

1.4. 如果小鼠在T1或T2時間10分鐘內(nèi)對兩個物體的探索都沒有達(dá)到20秒的最di時間，則排除在分析之外，因?yàn)闊o法確定它們是否花了足夠的時間來學(xué)習(xí)/辨別。

2. 絕對分析與相對分析

注:不同的分析公式及其相互關(guān)系見表1。

2.1 計算e1為2個相同物體訓(xùn)練時的總探索時間，其中a1和a2為相同物體。

E1 = a1 + a2

2.2 計算e2為測試熟悉物體(a)和新物體(b)的總探索時間。

e2 = a + b

2.3 d1簡單地計算為探索新物體所花費(fèi)的時間減去探索熟悉物體所花費(fèi)的時間。絕對鑒別測量(d1)沒有考慮小鼠或治療組之間探索時間的差異，盡管在某些情況下，它可能是一個更敏感的測量2。

d1 = b

2.4 d2是探索新物體所花費(fèi)的時間減去探索熟悉物體所花費(fèi)的時間除以總探索時間。zui常用的測量方法是相對判別值，通常稱為判別指數(shù)(d2)，不受探測時間差異的影響。所有的值都在-1和+1之間。

d2 = d1 / e2

2.5 或者，計算識別或偏好指數(shù)(d3)。這是花在探索新事物上的時間除以總時間。所有的值都在0和1之間，通常乘以100，用作百分比值。

d3 = b / e2 * 100

3. 統(tǒng)計分析

1. 使用每組的平均判別值進(jìn)行單向方差分析，確定記憶性能。為了進(jìn)一步分析，事后對治療組與載體組以及陽性/陰性對照組進(jìn)行雙向比較。

代表性成果

圖2顯示了ORT的一般實(shí)驗(yàn)設(shè)置。在習(xí)慣期(T0)小鼠被放置在曠場環(huán)境5分鐘。24小時后，小鼠被放置在兩個相同的物體的測試箱內(nèi)，允許自由探索長達(dá)10分鐘(T1)。在測試期(T2)，小鼠再次被放置在測試箱，但有一個熟悉的物體和一個新的物體，并允許探索長達(dá)10分鐘。T1和T2之間的停留時間間隔，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的最終目標(biāo)而改變。在有代表性的數(shù)據(jù)中，因?yàn)橐种苿┯型鰪?qiáng)記憶的影響，所以經(jīng)藥物處理的小鼠在T1后24小時內(nèi)被測試應(yīng)該沒有區(qū)別。

磷酸二酯酶2(Phosphodiesterase 2)抑制劑已被證明可以增強(qiáng)ORT中的學(xué)習(xí)和記憶。與之相比，PDE2抑制劑Bay 60-7550或ND7001在訓(xùn)練前30分鐘給予以劑量依賴性的方式顯著記憶增強(qiáng)(圖3a和3b)。在訓(xùn)練和測試的不同時間點(diǎn)給藥時，在訓(xùn)練前30分鐘、訓(xùn)練后立即和回憶前30分鐘給予給予 PDE2 抑制劑 Bay 60-7550 記憶明顯增強(qiáng)（圖 4a 和 4b）。這表明PDE2抑制增強(qiáng)了習(xí)得或早期鞏固機(jī)制以及回憶過程中的記憶。(本實(shí)驗(yàn)選用6 ~ 8周齡的實(shí)驗(yàn)未成熟雄性ICR小鼠。)

在實(shí)驗(yàn)設(shè)計時，必須考慮許多因素。小鼠的品種對探索時間和積極物體識別的保留時間都有很大的影響。S?k及其同事分析了一些常用的品系，包括C57BL、Swiss、BALB/c和129/Sv小鼠。結(jié)果表明，各品系總探查時間有統(tǒng)計學(xué)意義上的差異，其中Swiss和Balb/c的探查時間最長，C57BL和129/sv的探查時間最短。這會影響絕對區(qū)分值(d1)。此外，隨著時間的推移，保留時間顯著減少，129/Sv小鼠在1 h時d2值最di(圖5)。對于129/Sv品系，這可能是由于它們的探索水平較低，不一定是缺乏識別。值得注意的是，在本研究中，研究人員使用了較短的T1和T2(每次試驗(yàn)3 min)，這導(dǎo)致4個品系中只有2個品系達(dá)到了本文建議的最小20 s的探索時間。通常這個最小標(biāo)準(zhǔn)被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和探索對象所需的最小時間。這里引用的研究，證明了擁有這樣一個最di標(biāo)準(zhǔn)的重要性。

圖1:在ORT中使用的樣本物體。Lueptow等人使用的物體很簡單，但有幾個明顯的特征。所有的物體都比普通小鼠稍大一點(diǎn)，可以很容易地爬上去。從左到右依次是一個倒置的酒杯，一個帶膠帶的玩具積木，一個冰袋，一個有突出的眼睛的玩具積木?？刹鹦赌z體的將物體粘在底板上，以免在探索過程中移動或傾倒。

圖2:ORT的實(shí)驗(yàn)設(shè)計，ORT實(shí)驗(yàn)通常持續(xù)3天以上。第一天是習(xí)慣化(T0)，允許小鼠在開曠箱中探索5分鐘。第2天是訓(xùn)練(T1)，小鼠沿著對角線放置2個相同的物體去探索測試箱。測試(T2)在T1后24小時進(jìn)行(根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，間隔時間可以縮短或延長)。小鼠沿著對角線放置一個熟悉的物體和一個新奇的物體來探索測試箱。

圖3:ORT劑量依賴性記憶增強(qiáng)。(a) Bay 607550和(b) ND7001，當(dāng)訓(xùn)練前30分鐘給予時，以劑量依賴的方式改善記憶，從識別指數(shù)(d2)的增加可以看出。條形代表平均值±S.E.M.; N = 每組10-18。相較于載體小鼠p = 0.05， *p <0.05， **p <0.01， ***p <0.001.

圖4:習(xí)得、早期鞏固或回憶過程中的PDE2抑制劑顯著增強(qiáng)ORT中的記憶。(a) 607550 Bay (3 mg/kg)在訓(xùn)練(習(xí)得)前30分鐘給予，顯著增強(qiáng)記憶。(b)在訓(xùn)練(鞏固)后立即或測試(回憶)前30分鐘給予607550 Bay (3 mg/kg)顯著增強(qiáng)記憶，從識別指數(shù)(d2)的增加可以看出。條形代表平均值±S.E.M. N = 每組10-18。相較于載體小鼠p = 0.05， *p <0.05， **p <0.01， ***p <0.001.

圖5:品種不同的小鼠保持不同的時間間隔，C57BL、Swiss、BALB/c和129/Sv小鼠在不同時間間隔條件下的物體識別任務(wù)中相對識別指數(shù)d2的表現(xiàn)。所有的品種在間隔1小時時區(qū)分不同的物體，但在間隔4小時和24小時時不區(qū)分。值代表平均值(±S.E.M.)。虛線之間的區(qū)域表示虛組的s.e.m.范圍(均值:0，s.e.m.: 0.06)。

VisuTrack軟件可以準(zhǔn)確在新物體識別實(shí)驗(yàn)中檢測動物的鼻尖、重心和尾巴，多重復(fù)雜因子同步判斷，詳細(xì)咨詢可掃碼添加工程師張工。